FA2018. p.208 apoptosis 相關實驗

 FA2018. p.208 apoptosis這邊有一行:

DNA laddering (fragments in multiples of 180 bp) is a sensitive indicator of apoptosis

這句話是什麼意思?!

看FA看不懂, 來查youtube關鍵字: DNA laddering apoptosis

好像沒有特別有名品牌channel的影片, 看點閱率跟呈現方式, 先選了這個

然後看這個影片跟大家分享筆記

https://www.youtube.com/watch?v=dVSVO39-Ok8

請搭配影片服用~

Apoptosis其實蠻多assay的

先介紹 DNA fragmentation assay (應該就是FA上的)

牽涉到一個enzyme叫DNase, 通常DNase不會作用, 因為被ICAD bind著

假設現在有ICAD inhibitor,把ICAD除掉, 那就讓DNase自由了,可以作用

DNase的作用是什麼? cleave DNA, 會把DNA切成一段一段的,基本上是每一段200bp (FA寫180)

但是因為DNase是randome切, 所以不一定連續切, 所以可能會空一些片段, 然後後面繼續切200 bp

(以前生化好像有教過?)

反正結論是切出來的fragment, 有些200 bp.  有些400 bp. 有些600 bp., 理論上是200的倍數(?)

下面介紹另一個assay: DAPI stain

(DAPI是一種化合物,全名: DAPI [4,6-Diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride])

DAPI會發出一個波長的光, 然後會bind DNA,所以我們可以根據DAPI發出的光,來推論DNA的狀況,是完整還是被片段化(fragmented, 如果有apoptosis進行)

有光就有數據,這個assay可以定量

 

DAPI下只會看到nuclei (內有DNA)

細胞膜是看不到的, 沒stain (雖然其實存在,完整)

沒有apoptosis, 染了DAPI會看到完整nuclei

有apoptosis, 染了DAPI會看到 fragmented nuclei

下一個介紹TUNEL assay

TUNEL是Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling (TdT dUTP nick end labeling )

TdT在免疫有講過

在B cell發育, heavy chain重組時, TdT (terminal deoxynucleotidyl transferase) (這個enzyme (DNA polymerase)（在重組過程中插入 N-nucleotides），形成 junctional diversity, 增加抗體多樣性

參考資料: https://dailyimmunology.blogspot.com/2020/07/development-of-naive-b-cell.html

 

補充FA2020 p. 432, TdT+是pre-T and pre-B cells的marker (因為要進行heavy chain重組recombination)

不成熟的lymphoblast有TdT (包含T跟B)

成熟的lymphocyte沒有TdT

然後不成熟的myeloid blast也沒有TdT

所以TdT 可以很專一性的代表不成熟的lymphoblast (而不實myeloid那一支)

 

那ALL有很多 不成熟的lymphoblast, 所以TdT (+)

反正TdT這個enzyme, 就是可以在free的 double strand DNA的end端點, 加入nucleotide

沒有apoptosis的DNA, 只有2個free end, 所以只有2個位置可以給TdT作用

有apoptosis的DNA, 因為DNA被fragmentation, 所以有很多個free end, 所以TdT可以bind的位置很多

 

然後偵測TdT 的signal (代表activity)

沒有apoptosis的細胞TdT 的signal就很少 (少作用→不亮)

有apoptosis的細胞TdT 的signal就很多 (很多作用→很亮)

結論: 看完影片, 我會在FA這一句(DNA laddering (fragments in multiples of 180 bp) is a sensitive indicator of apoptosis)用中文寫下結論, 方便下次翻閱複習: 

也可以做anki

在正常情況下 (沒有apoptosis),把DNA 拿來跑電泳只會看到一團DNA, 大分子, 跑不遠

但是假如有 apooptosis, 把細胞核的DNA切成一段一段的 (fragmentation的意思),那 拿來跑電泳就會看到一段一段,不同分子量的DNA, 小分子, 跑得比較遠

所以如果看到電泳一段一段, 代表細胞核的DNA被切成一段一段,可能有進行apopotosis

apoptosis用哪個apoptosis cell 用什麼去結合macrophage, 讓macrophage 清除掉?

所以補充這個影片, 有新的apoptosis assay, 有新的probe可以detect apoptosis

https://www.youtube.com/watch?v=VlUYub5ey_k

影片只看前半段就好, 因為 後半段是商業賣東西介紹

我們只要知道關鍵的最小必要知識架構術(Minimum Viable Knowledge Structure):

在apoptosis初期, phosphatidylserine會從細胞膜內層 移動到 細胞膜外層

所以如果用化學試劑偵測到細胞膜外層的phosphatidylserine→代表在進行apoptosis

有數不清種化學試劑或assay, 但是關鍵就是這個

細節:

正常來說, 一個細胞, 細胞膜的兩側 (向細胞內側跟向細胞外側),上面會有不同的lipid駐紮 (有些可以跑來跑去,但大部分會固定待在一側)

AMBOSS有寫:

Outer lipid layer: rich in phosphatidylcholine and sphingomyelin

Inner lipid layer: rich in phosphatidylserine, phosphatidylethanolamine, and phosphatidylinositol

補充osmosis youtute上 sphingomyelin 在細胞膜外層的圖~

那今天的主角就是在細胞膜內層的phosphatidylserine

在apoptosis初期, phosphatidylserine會從細胞膜內層 移動到 細胞膜外層

所以移動到細胞膜外層的phosphatidylserine translocation, 可以做為 apoptosis的hallmark

(還記得apoptosis跟 necrosis都是cell death, 但是apoptosis不會引發inflammation, necrosis會引發inflammation, 這個phosphatidylserine translocation可以可以解釋為什麼apoptosis不需要引發inflammation, macrophage就可以把old cell apoptosis, 就是因為他們phosphatidylserine translocation,所以經過old cell的macrophage就可以辨認這個不應該在細胞膜外膜的phosphatidylserine (PS),就對她啟動apoptosis, 而沒有 啟動inflammation反應 )

(這個影片其實就是在賣一個新發明的試劑,比傳統的即時real time,有螢光可以看,就是用reagent化學試劑來偵測phosphatidylserine translocation (或叫Phosphatidylserine Externalization)),不重要

參考資料:

https://biosignaling.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12964-019-0437-0

心得: (可不看)

狂看影片英文聽力真的會進步,想當初開始準備的時候,1X速都要常常暫停,或是調0.7X倍速才能完全聽懂

現在都可以1.5-2X倍速了,超爽

回想高中物理,解釋的物理現象,都會搭配一個實驗,講這個原理是怎麼證明的

學病理是否也可以這樣, 每一個新學到的觀念 (例如apoptosis),都一起看看如何用實驗方法來證明他

考試會考很多實驗題, 可能也是想設計來考,有沒有真正懂觀念

例如apoptosis, 不能只是死背, 細胞核會fragmentation (考試又不是填空)

而是要知道, fragmentation 的意思/意義/做實驗可能看到的

細胞核fragmentation 會變成很多片段, 所以跑DNA電泳會看到一段一段的 laddering

而不是 一整塊